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七葉一枝花（Paris polyphylla）為百合科重樓屬多年生草本植物，別名重樓、草河車、七葉蓮等，主要分布于江西、浙江、廣東、四川、貴州等省。七葉一枝花以根莖入藥，具有清熱解毒、消腫止痛等功效，多用于治療無名腫毒和毒蛇咬傷，以及流行性腮腺炎、扁桃體炎、咽喉腫痛等。七葉一枝花種子具有明顯的后熟特點，胚需要休眠完成后熟才能萌發，在自然條件下經過2個冬天才能出土成苗，且成苗率較低[1]。七葉一枝花種子繁殖的關鍵是打破其休眠，促進生理后熟，使其快速出苗。層積、低溫、赤霉素（GA3）和聚乙二醇（PEG）均能提高種子的萌發率，打破種子的休眠期，縮短種子出苗時間。

獲得良好的胚性愈傷組織是七葉一枝花組織培養成功的關鍵因素。影響七葉一枝花愈傷組織誘導和培養條件的因素主要包括外植體的選擇及預處理、培養基成分、培養條件及植物激素等。雖然國外學者對延齡草屬植物的組織培養獲得了成功，誘導出小根莖，但在培養過程中無法誘導出愈傷組織[2]。筆者研究七葉一枝花種子萌發和組織培養，以期為其大規模生產提供技術支撐。

1材料與方法

1.1試驗材料

供試七葉一枝花成熟種子采集于云南大理，經中南民族大學劉學群教授鑒定后置于冰箱的密封塑料袋內使其腐爛，用水流強的自來水洗去穎殼，用手搓揉種子外種皮并用細孔篩篩去紅色漿果的外種皮，余下白色種子，晾干后人工除殘留物，4 ℃保存備用。

1.2種子萌發試驗

1.2.1浸種處理。

用不同濃度赤霉素（GA3）浸泡七葉一枝花種子24 h，以蒸餾水作為對照，置于20 ℃培養箱。24 h后倒掉溶液，用自來水沖洗種子，直至洗凈殘留液體為止，再用蒸餾水沖洗，無菌條件下處理種子。

1.2.2無菌處理。

在超凈工作臺內，用無菌水沖洗種子3～5次，然后使用75%乙醇消毒30 s（乙醇回收利用），無菌水沖洗3～5次，再用0.1%HgCl2浸泡10～15 min（乙醇回收，集中處理），無菌水沖洗3～5次，后置于無菌的150 mm帶濾紙的培養皿內培養。

1.2.3培養條件。

將種子按一定比例埋藏于基質濕沙中，然后將其置于4 ℃下處理60 d，再將溫度調至18～20 ℃放置90 d，再調至低溫（6～8 ℃）放置60 d，后置于20～22 ℃處理60 d，然后播種在土壤中萌發，留一個缽子的種子繼續濕沙層積。種子萌發的標志以胚根剛突破種皮作為標準，萌發率=萌發的種子數/種子總數×100%[3]。

1.2.4試驗設計。

GA3濃度為100、150和600 mg/L，對照為相同體積的雙蒸水。采用單因素設計，3次重復，每次取100粒種子。

1.3種子的組織培養

1.3.1培養基的準備。

基本培養基為1/2MS，添加不同濃度的6BA（0.1、0.5、0.7、1.0、1.4和2.0 mg/L）和0.5 mg/L NAA，之后分裝在500 mL三角瓶內，每瓶裝300 mL，于121 ℃高壓滅菌20 min，冷卻至不燙手時分裝于50 mL已滅菌的三角瓶內，每瓶倒30 mL，備用。

1.3.2種子的消毒與接種。在超凈工作臺上用無菌水清洗種子外植體3～5次，然后放入盛有75%乙醇的燒杯中浸泡30 s并輕輕搖晃，后用無菌水清洗3～5次，再用0.1%HgCl2浸泡種子外植體10～15 min（不斷搖晃燒杯，保證所有外植體均勻接觸溶液），無菌水洗3～5次，后用無菌濾紙吸干種子表面的水分，接種于愈傷組織誘導培養基[4-5]。

1.3.3培養條件。

溫度（18±2）℃，濕度70%，光照條件1 000 μmol/（m2·s），光照時間12 h/d。

2結果與分析

2.1濕沙基質中種子的萌發情況

濕沙基質層積240 d后，將種子播于土壤中萌發，結果100 mg/L GA3溶液浸泡48 h種子的萌發率為95.35%（圖1 a）；150 mg/L GA3溶液浸泡種子48 h的萌發率為98.51%（圖1 b）；600 mg/L GA3溶液浸泡種子48 h的萌發率僅為55.81%（圖1 c），剩余種子均干死，無法得到充足的水分。

濕沙基質層積240 d后，將種子留在濕沙基質中，繼續恒溫18 ℃培養，120 d后，種子的胚根已經木質化發育成主根，且有3株種子的種殼已經脫落，露出包裹的子葉，在每個根莖部位均分化出側芽；360 d后，胚乳的營養已被逐漸耗盡，種皮漸變成黑色，直至干枯自然脫落，子葉明顯可見（圖1 d）。

濕沙基質試驗過程中發現，僅高溫或低溫并不能打破種子休眠，而是需要高低溫的交替；采用不同濃度的GA3浸泡種子，然后進行低溫層積和18 ℃培養箱層積，結果低溫層積種子未發芽，原因可能是七葉一枝花種子的胚發育不完全。

安徽農業科學2016年

2.2長出胚根的種子在土壤中的萌發情況

將胚根長至3～4 cm的種子于春季栽種在缽子里，其上覆蓋一層2 cm左右的土，第一次澆透定根水，之后每隔3～5 d澆水，放于光照培養箱內，溫度為（18±2） ℃，濕度為70%，弱光照條件下觀察生長情況。另一部分于相同時間種在小缽子內，在湖北省恩施土家族苗族自治州的自然條件下，挖土一定的深度放入缽子與地面相平，溫度、光照時間和濕度均在不斷檢測中。

光照培養箱和自然條件栽種的種子均能長成心形幼苗，說明各種處理方法均能獲得大量種苗，此方法是可行的。光照培養箱七葉一枝花的種子在其外面還殘留部分鱗莖，阻礙子葉展開，而自然條件下七葉一枝花的種子已經長成心形幼苗，比光照培養箱內長得快且長勢良好。其原因是光照培養箱培養條件較恒定，通風狀況較差，若水澆多，會在其上出現一層白膜，而自然條件下不僅通風良好且不會存積水分，自然條件下生長的七葉一枝花幼苗比光照培養箱生長的快和好（圖2）。

經過上述方法打破七葉一枝花種子的休眠期，需要180～210 d，種子可形成心形單葉幼苗。

2.3不同濃度6-BA對種子愈傷組織的影響

種子外植體形成愈傷組織的適宜培養基為1/2MS（大量元素、微量元素、有機溶劑和鐵鹽都為MS培養基的50%）+0.1 mg/L 6-BA +0.5 mg /L NAA。試驗過程中發現，在種子外植體愈傷組織誘導初期對培養基的要求較低，說明培養初期胚乳可以提供種子所需要的養分。6-BA 是植物組織培養中使用較廣泛的一種細胞分裂素，且在許多植物上表現出較強的誘導不定芽形成的能力。該試驗結果也說明6-BA用于種子不定芽的誘導是適宜的，且佳濃度為0.1 mg /L。隨著6-BA濃度的增加，誘導不定芽的能力增強，同時外植體開始褐化，因此，在一定濃度范圍內，高濃度的6-BA對誘導不定芽的形成是不合適的。

雖然是相同濃度的激素，但種子外植體誘導的效果不同，有的能直接形成愈傷組織，有的能形成愈傷組織和長出芽。種子外植體形成的愈傷組織（圖3 a），在整個種子的周圍形成一圈愈傷組織，愈傷組織較松散且易碎，誘導效果不理想。選擇長勢好的愈傷組織進行分化培養，一段時間后發現，愈傷組織不同程度地褐變甚至顏色變黑，未分化出苗，既有愈傷組織又有芽的種子外植體也開始褐變和變黑（圖3 b和圖3 c），但種子長出的芽可以進一步生長和發育（圖3 d～f）。

6-BA能有效地被種子外植體所吸收，致使6-BA富集，且誘導的不定芽在含有6-BA的培養基上繼代幾次后，其玻璃化程度不斷加重，說明種子外植體有富集細胞分裂素6-BA的傾向。

雖然種子誘導出的愈傷組織未分化出苗，然而觀察發現其種子先長出胚根，露出種子之外（圖4 a～c），隨著胚根的不斷發育和進一步對種子進行誘導分化（圖4 d～f），胚根向下生長，形成主根；與此同時，胚軸細胞也相應地生長和伸長，把胚芽連同子葉一起推出；后胚芽突出種皮，向上生長，形成莖和葉，獲得了無菌苗（圖4 g～i）。由此可知，七葉一枝花是子葉出土萌發。

3結論

研究結果表明，七葉一枝花種子快速萌發期由2 a縮短為0.5 a，萌發率由10%～46%提高到90%以上。150 mg/L GA3處理種子的萌發率高。在七葉一枝花育苗、栽培生產中可以選擇這些植物激素，提高其出苗率和幼苗成活率。

較高濃度GA3有利于種子萌發，低濃度則使萌發率下降。先用水溶液浸泡種子，使種子充分吸脹，再用GA3溶液浸泡，有利于種子充分吸收GA3溶液。GA3不僅能誘導水解酶類的合成，也能促進酶的分泌，水解貯藏物質供胚生長的小分子化合物，促進種子萌發，且促進效果明顯。

種子外植體合適的愈傷組織誘導培養基為添加0.1 mg/L 6-BA和0.5 mg /L NAA的 1/2MS基本培養基，誘導的愈傷組織比較松散，濕度大，且易碎?？煽紤]使用未成熟的種子胚，此時胚比較幼嫩和容易獲得；根莖和種子外植體都能誘導出愈傷組織，但均未分化出苗。后續試驗考慮使用正交試驗篩選出合適的愈傷組織分化培養基，獲得植物體，以期為解決種苗問題提供理論指導。

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